超低溫保存技術在果樹種質資源保存中的應用及國內外研究進展 MVE液氮罐

摘要：超低溫保存是作物種質資源離體保存的有效方法之一。本文概述了超低溫保存技術在果樹種質資源保存中的應用及國內外研究進展，對存在的問題進行了分析，并對其發展提出了建議。

關鍵詞：果樹;種質資源;離體保存

植物種質超低溫保存是指在低于-196℃的低溫條件下對植物器官、組織或細胞進行保存。在這樣的低溫條件下，植物材料的代謝和生長活動幾乎完全停止，因此，能夠有效保持材料的遺傳穩定性，同時又不會喪失其形態發生的潛能。所以，這是一種不需要繼代的長期保存植物種質的，也是果樹品種改良和分子遺傳學研究的前提和基礎。

隨著現代果品業的發展，種質資源的重要性越來越被重視。1968年Quatran成功地保存了亞麻細胞，拉開了植物冰凍保存的帷幕。1973年Nag和Street超低溫保存胡蘿卜懸浮細胞獲得成這是植物種質超低溫保存的首次報道，之后超低溫保存技術在植物種質保存方面的研究和應用逐漸深入。

將超低溫保存技術與組織培養技術相結合，可以將大量的果樹種質儲存在液氮罐中。這種保存形式的優點是果樹的種質保存不受土地、人力等條件的限制且取材方便、效率高、極大地節省開支;此外，還可以避免種質保存過程中的自然變異，保證種質的遺傳穩定性，同時有利于種質在國際間的交換。

1、材料的選擇

由于植物的基因型、抗凍性以及器官、組織和細胞的年齡、生理狀態等因素對超低溫保存效果有較大的影響，從而要求在整個保存處理過程中采取相應的符合其材料特性的各種措施。不同基因型的植物材料對超低溫保存的反應各不相同，凍后存活率的顯著差異不僅存在于種間，也存 在于不同品系間。趙艷華等(1998)在包埋干燥超低溫保存蘋果離體莖尖時發現，材料的生理狀態對莖尖存活率的影響甚至比保存過程中處理 因素的影響更大。因此， 在進行超低溫保存前，對材料的選擇十分重要。可以進行超低溫保存的材 料種類很多，主要分為4類：①莖尖和側生分生組織;②原生質體;③懸浮培養物、愈傷組織和 體細胞胚;④其他植物器官，如胚、子房、花粉、 花藥、種子等。

2、超低溫保存種質資源的研究進展

2.1 超低溫保存技術在蘋果和梨中的研究進展 邵建柱(2003)[11] 對蘋果等果樹種質資源的 離體保存進行了研究，通過對試管苗狀態的調整、外植體類型及大小的選擇，結合密閉減少氧氣供應和水分蒸發，成功地建立了適合蘋果等果樹離體材料的常溫緩慢生長法保存技術。確定了15個梨品種離體莖段培養物的通用繼代培養基，即MT+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA+2.0mg/LGA3，為梨的離體保存研究初步奠定了基礎。同時還完善了蘋果和梨離體莖段的常低溫保存技術，使得蘋果和梨離體莖段在(3±0.5)℃條件下，保存28個月和24個月后，仍保持近100%存活率。進一步完善了蘋果莖段的超低溫保存技術，確立了甘油和ABA在預處理中的重要作用。

以蘋果離體莖尖為試材，對蘋果離體莖尖超低溫保存方法比較發現，包埋干燥法操作程序簡單，存活率及再生率高，為最佳的保存方法。

2.2超低溫保存技術在枇杷中的研究進展

采用干凍化法對枇杷花粉超低溫 保存進行了研究。結果表明：花粉的含水量是決定枇杷花粉超低溫保存成敗的關鍵因素， 30%左右的含水量能夠保證超低溫保存后花粉的活力;解凍溫度及方式對超低溫保存后花粉的存活力沒有明顯影響。

對經過干燥脫水至不同含 水量的枇杷離體花粉進行了超低溫(-196℃)保存試驗。結果表明：超低溫保存花粉時，花粉的含水量多寡是成敗的關鍵。對于枇杷而言，選擇含水量為13%左右的花粉比較合適。花粉在液氮 中保存2、8h和24h，其發芽率無顯著差異。

2.3 超低溫保存技術在百合中的研究進展

對百合莖尖玻璃化超低溫保存基本條件進行了研究，發現前處理和解凍方 式是影響超低溫保存存活率的主要因素。

以百合試管苗莖尖分生組織為材料，對玻璃化法超低溫保存技術進行了實驗研究，并通過正交設計試驗對影響超低溫保存存活率的主要影響因素(預培養基中蔗糖濃度、預培養時間和PVS2處理時間)進行了分析，初步建立了百合種質超低溫保存的最佳技術方案。

2.4 超低溫保存技術在櫻桃中的研究進展

櫻桃種質資源的離體保存研究起步較晚，目前尚未見大規模離體保存庫建立的報道。Marthe對兩個櫻桃的中間砧進行過液氮超低溫保存研究。Niino采用PVS2玻璃化液對5個甜櫻桃品種和2個櫻桃砧木進行超低溫保存，試驗中所使用的玻璃化液中DMSO對材料具有毒害作用，高含量的蔗糖又會加劇材料的褐化，導致保存后 莖尖再生困難。趙艷華等(1999)對馬哈利櫻桃的超低溫保存研究發現PVS3的效果最好。 牛愛國在MS培養基中添加10g/L甘露醇可使試管苗保存7.5個月，母株存活率62%，繼代后成 活率83%。

2.5 超低溫保存技術在其它植物中的研究進展

以離體培養的栗子莖尖為 材料，對超低溫保存過程中的影響因素進行研究， 所有基因型的材料均獲得再生植株，有的高達38%～54%，建立了有效的超低溫保存程序。

對木瓜的超低溫保存技術進行了研究，建立了高效率的超低溫保存的玻璃化程序：即在含有0.09mol/L蔗糖的MS培養基上繼代培養45～50d，然后轉移至2.0mol/L丙 三醇+0.4mol/L蔗糖的培養基中， 25℃下包埋處理60min;然后轉移至PVS2中， 0℃脫水處理80min，然后迅速投入液氮中，經過解凍處理獲得90%的再生率，是一種高效的超低溫保存木瓜方法。

采用玻璃化法對草莓莖尖的離體超低溫保存進行了初步研究。研究表明，預培養12d的莖尖存活率最高，為82.4%;其次 為6d， 為77.8%;不經預培養的最差，為15.8%。不同品種的成活率和成苗率有差異，寶交早生的 成活率高于UC5，而寶交早生成活莖尖的成苗率(79%)低于UC5(100%)。

首次采用玻璃化法對荔枝 胚性懸浮細胞進行超低溫保存。適宜的保存程序為：取換液后3～5d的胚性懸浮細胞→0.4mol/L的山梨醇液中預培養2d→室溫下60%PVS2預處理15min→0℃下PVS2處理15～20min→迅速投入液氮→40℃水浴快速化凍→1.2mol/L蔗糖+MS基本培養基洗滌→TTC檢測和恢復生長。TTC檢測保存細胞的相對存活率高達27.1%。

3、超低溫保存中存在問題

3.1 冰凍保護劑

目前使用的冰凍保護劑種類很多，按其是否 能滲透到細胞內，可將冰凍保護劑分為兩類：一是滲透性冰凍保護劑，包括二甲基亞砜、甘油、乙二 醇、 丙二醇、乙酰胺等，此類冰凍保護劑多數為低分子中性物質，在溶液中易結合水分子發生水合作用， 使溶液的粘性增加，弱化了水的結晶過程，從而起到了保護效果;二是非滲透性冰凍保護劑，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等，這類物質能溶于水，但不能進入細胞，它能使溶液呈過冷狀態，從而起到保護作用。

發現海藻糖能與磷脂相互作用而穩定細胞膜結構，防止冰凍對細胞膜造成直接損傷， 因而它也被用作冰凍保護劑。Bhandal等用海藻糖作唯一的冰凍保護劑， 成功地保存了胡蘿卜、煙草等細胞培養物。另外，脯氨酸也可作為冰凍保護劑起到穩定凍存細胞中蛋白質結構的效果。 實驗發現，單獨使用一種冰凍保護劑，其保存效果并不理想，近幾年來，國內外許多研究都在嘗試采用復合冰凍保護劑。復合冰凍保護劑的 優越性在于它能充分發揮各種成分的保護作用， 從而產生累加效應。10%或5%二甲基亞砜(DMSO)配合一定濃度的甘油或糖，能顯著提高超低溫保存后的成活率，而其中糖的種類也因保存材料不同而異。

作為冰凍保護劑應具備以下3個特性：易溶 于水;在適當的濃度范圍內是無毒的;化凍后易從保存材料中清除。另外， 冰凍保護劑處理應在低溫下進行，而且處理時間不宜過長，一般為20～120min。如桑芽用0.5mol/L山梨糖醇液浸漬過夜，再用10%DMSO與0.5mol/L山梨糖醇液浸漬處理20min，能顯著提高超低溫保存后的 成活率。

3.2 再生植株的遺傳性狀和表型特征的變化

對超低溫保存木瓜的基因 型和表觀遺傳變化的研究發現，經過超低溫處理 的再生植株， DNA的甲基化修飾最高達6.62%，并檢測到了相應目的條帶。

對超低溫保存的金絲桃再生植株的遺傳和生化特征進行分析研究，結果表明處理植株的再生率和染色體數目均具有穩定性，僅在非編碼序列存在微量的突變。

有研究發現，經過低溫處理的人參在產量方 面未發生變化;超低溫保存的紫錦蘇組培植株，同對照具有相同的生長速率和產品特性。

3.3 超低溫保存中超微結構的變化

研究表明：預培養降低了細 胞的液泡化程度，線粒體嵴變得更為發達，同時細胞的代謝活性增加，而未經預培養的細胞凍后很 難存活。保護劑處理為超低溫保存的關鍵環節，但保護劑處理可造成細胞損傷，從超微結構上 看引起核周隙擴張、膜囊泡化及細胞骨架的塌陷。

在對香蕉莖尖進行超低溫保存的過程中，Heliot等(2003)對保存材料在各個步驟的超微結構變化進行了連續觀察， 結果表明無論在冷凍/解凍步驟還是冷凍保護劑處理期間，大部分分生組織細胞都受到損傷，僅位于分生組織圓頂周邊極小范圍內的細胞存活下來。

4、展望

種質資源是產業安全和可持續發展的戰略資 源，世界各國十分重視種質資源的收集和創新利 用。目前我國果樹種質資源保存的主要手段是圃地保存和組培保存，圃地保存占地大、管理費時費工，并且受到氣候條件、病蟲害等威脅;組培保存存在著易感染、費工費電、雜合個體性狀容易退化、生活力下降等缺點。

超低溫冷凍離體保存能夠彌補以上不足，該方法建立在生物細胞凍害和抗凍機理的基礎上。種質超低溫保存成功的關鍵在于降溫冰凍過程中避免細胞內結冰，為此，針對不同種類的植物材料，篩選適合的冰凍保護劑，采用適當的降溫冰凍速度和化凍方式，可使細胞不受損傷或使損傷減 小到最低程度。目前的研究表明， 影響植物材料超低溫保存效果的因素很多，不同的植物或同一 植物的不同材料類型，其保存的難易和效果均不同。因此，要根據材料本身的特性，對影響保存的因素進行研究，尋找提高超低溫保存成活率和再生率的有效途徑和方法，從而達到成功保存種質資源的目的。

目前，超低溫保存技術的研究大多停留在方法上，供試種質材料的保存時間短，少有長期保存再生情況的報道，對離體種質保存過程中遺傳穩定性的研究也很少，研究對象范圍狹窄，而且對同一物種不同品種的研究結果也不盡一致。因此，今后的研究方向一是重點選擇需優先保護的瀕危 物種， 用已成熟的技術進行較大規模的中長期保存及遺傳穩定性試驗，探討超低溫保存的實際應用效果;二是對已經建立完善再生體系且在生產上具有重要經濟價值的果樹， 例如櫻桃、核桃、板栗、梨、棗、藍莓等，探索安全簡便、長期穩定的超低溫保存技術體系。MVE液氮罐